O veleno de serpe contén encimas que hidrolizan enlaces éster carboxílico.Os substratos para a hidrólise son os fosfolípidos, a acetilcolina e o acetato aromático.Estes encimas inclúen tres tipos: fosfolipase, acetilcolinesterase e esterase aromática.A arginina esterase no veleno de serpe tamén pode hidrolizar a arginina ou a lisina sintéticas, pero principalmente hidroliza os enlaces peptídicos das proteínas na natureza, polo que pertence á protease.Os encimas que se comentan aquí só actúan sobre substratos ésteres e non poden actuar sobre ningún enlace peptídico.Entre estes encimas, as funcións biolóxicas da acetilcolinesterase e da fosfolipasa son máis importantes e foron totalmente estudadas.Algúns velenos de serpes teñen unha forte actividade de esterasas aromáticas, que poden hidrolizar o éster etílico de p-nitrofenilo, o acetato de naftaleno a - ou P e o éster etílico indol.Aínda se descoñece se esta actividade é producida por un encima independente ou un efecto secundario coñecido da carboxilesterase, e moito menos o seu significado biolóxico.Cando o veleno de Agkistrodon halys Japonicus reaccionou co éster etílico de p-nitrofenilo e o éster etílico indol, non se atoparon os hidrolizados de p-nitrofenol e fenol indol;Pola contra, se estes ésteres reaccionan co veleno de serpe da subespecie cobra Zhoushan e o veleno de serpe Bungarus multicinctus, hidrolizaranse rapidamente.Sábese que estes velenos de cobra teñen unha forte actividade colinesterasa, que pode ser responsable da hidrólise dos substratos anteriores.De feito, Mclean et al.(1971) informaron de que moitos velenos de serpes pertencentes á familia Cobra poden hidrolizar o éster etílico indol, o éster etílico naftaleno e o éster butilnaftaleno.Estes velenos de serpe proveñen de: cobra, cobra de pescozo negro, cobra de beizo negro, cobra dourada, cobra exipcia, cobra real, mamba cobra dourada, mamba negra e mamba de beizo branco (D. aw aínda coñece a serpe de cascabel de rombo oriental).
O veleno de serpe pode hidrolizar o éster etílico de metilindol, que é o substrato para determinar a actividade da colinesterasa no soro, pero este veleno de serpe non mostra actividade da colinesterasa.Isto mostra que hai unha esterase descoñecida no veleno de cobra, que é diferente da colinesterasa.Para comprender a natureza deste encima, é necesario un traballo de separación adicional.
1, Fosfolipase A2
(I) Visión xeral
A fosfolipase é un encima que pode hidrolizar o glicerilfosfato.Existen 5 tipos de fosfolipase na natureza, a saber, a fosfolipase A2 e a fosfolipase.
A. , fosfolipase B, fosfolipase C e fosfolipase D. O veleno de serpe contén principalmente fosfolipase A2 (PLA2), algúns velenos de serpes conteñen fosfolipase B e outras fosfolipases atópanse principalmente en tecidos animais e bacterias.A figura 3-11-4 mostra o lugar de acción destas fosfolipases na hidrólise do substrato.
Entre as fosfolipases, a PLA2 estudouse máis.Pode ser o encima máis estudado no veleno de serpe.O seu substrato é o enlace éster na segunda posición do Sn-3-glicerofosfato.Este encima atópase amplamente no veleno de serpes, no veleno de abellas, no veleno de escorpión e nos tecidos animais, e o PLA2 é abundante en catro velenos de serpes familiares.Debido a que esta enzima rompe os glóbulos vermellos e provoca hemólise, tamén se lle chama "hemolisina".Algunhas persoas tamén chaman lecitinase hemolítica PLA2.
Ludeeke descubriu por primeira vez que o veleno de serpe pode producir un composto hemolítico ao actuar sobre a lecitina a través de encimas.Máis tarde, Delezenne et al.demostrou que cando o veleno de cobra actúa sobre o soro ou a xema de cabalo, forma unha substancia hemolítica.Agora sábese que o PLA2 pode actuar directamente sobre os fosfolípidos da membrana dos eritrocitos, destruíndo a estrutura da membrana dos eritrocitos e provocando hemólise directa;Tamén pode actuar sobre o soro ou a lecitina engadida para producir lecitina hemolítica, que actúa sobre os glóbulos vermellos para producir hemólise indirecta.Aínda que o PLA2 é abundante nas catro familias de velenos de serpes, o contido de encimas en varios velenos de serpes é lixeiramente diferente.Cascabel (C
O veleno de serpe só mostrou unha actividade de PLA2 débil.A táboa 3-11-11 ilustra a comparación da actividade PLA2 dos 10 velenos principais de serpes velenosas en China.
Táboa 3-11-11 Comparación das actividades da fosfolipase VIII de 10 velenos de serpes en China
Veleno de serpe
Liberación de graxa
ácido alifático,
Cjumol/mg)
Actividade hemolítica CHU50/^ g * ml)
Veleno de serpe
Liberar ácidos graxos
(^raol/mg)
Actividade hemolítica "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
once
Micracephal ofis
cinco coma un cero
kalyspallas
8. 68
dous mil oitocentos
gracilis
V, agudo
7. 56
*** #
Ophiophagus hannah
tres punto oito dous
cento corenta
Bnugarus fasctatus
7,56
douscentos oitenta
B. multicinctus
un punto nove seis
douscentos oitenta
Viper a russelli
sete punto cero tres
T, mucroesquamato
un punto oito cinco
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
(2) Separación e purificación
O contido de PLA2 no veleno de serpe é grande e é estable á calor, ácido, álcali e desnaturalizante, polo que é fácil de purificar e separar o PLA2.O método común é levar a cabo primeiro a filtración en xel sobre o veleno bruto, despois realizar a cromatografía de intercambio iónico e o seguinte paso pódese repetir.Nótese que a liofilización de PLA2 despois da cromatografía de intercambio iónico non debe causar agregación, porque o proceso de liofilización adoita aumentar a forza iónica do sistema, que é un factor importante que provoca a agregación de PLA2.Ademais dos métodos xerais anteriores, tamén se adoptaron os seguintes métodos: ① Wells et al.② O análogo de substrato de PLA2 utilizouse como ligando para a cromatografía de afinidade.Este ligando pode unirse ao PLA2 no veleno de serpe con Ca2+.O EDTA úsase principalmente como eluyente.Despois de eliminar o Ca2+, a afinidade entre a PLA2 e o ligando diminúe e pódese disociar do ligando.Outros usan solución orgánica ao 30% ou urea 6mol/L como eluyente.③ Realizouse a cromatografía hidrofóbica con PheiiylSephar0SeCL-4B para eliminar o trazo de PLA2 na cardiotoxina.④ Anticorpo anti PLA2 utilizouse como ligando para realizar a cromatografía de afinidade sobre PLA2.
Ata agora, un gran número de veleno de serpe PLAZ foi purificado.Tu et al.(1977) enumeraron o PLA2 purificado a partir do veleno de serpe antes de 1975. Nos últimos anos, informouse dun gran número de artigos sobre a separación e purificación do PLA2 cada ano.Aquí centrámonos na separación e purificación do PLA por parte dos estudosos chineses.
Chen Yuancong et al.(1981) separaron tres especies de PLA2 do veleno de Agkistrodon halys Pallas en Zhejiang, que se poden dividir en PLA2 ácido, neutro e alcalino segundo os seus puntos isoeléctricos.Segundo a súa toxicidade, o PLA2 neutro é máis tóxico, que foi identificado como neurotoxina presináptica Agkistrodotoxin.O PLA2 alcalino é menos tóxico e o PLA2 ácido case non ten toxicidade.Wu Xiangfu et al.(1984) compararon as características de tres PLA2, incluíndo o peso molecular, a composición de aminoácidos, o N-terminal, o punto isoeléctrico, a estabilidade térmica, a actividade enzimática, a toxicidade e a actividade hemolítica.Os resultados mostraron que tiñan un peso molecular e unha estabilidade térmica similares, pero tiñan diferenzas significativas noutros aspectos.No aspecto da actividade enzimática, a actividade enzimática ácida era maior que a actividade enzimática alcalina;O efecto hemolítico da enzima alcalina sobre os glóbulos vermellos da rata foi o máis forte, seguido da enzima neutra e a enzima ácida case non hemolizada.Polo tanto, especúlase que o efecto hemolítico do PLAZ está relacionado coa carga da molécula de PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) elaboraron cristais de Agkistrodotoxina.Tu Guangliang et al.(1983) informaron de que un PLA tóxico cun punto isoeléctrico de 7.6 foi illado e purificado do veleno de Vipera rotundus de Fujian, e as súas propiedades físicas e químicas, a composición de aminoácidos e a secuencia de 22 residuos de aminoácidos no N. -terminal foron determinados.Li Yuesheng et al.(1985) illaron e purificaron outro PLA2 do veleno de Viper rotundus en Fujian.A subunidade do PLA2 * é 13 800, o punto isoeléctrico é 10,4 e a actividade específica é de 35/xnioI/miri mg。 Con lecitina como substrato, o pH óptimo do encima é 8,0 e a temperatura óptima é 65 ° C. LD5 inxectado por vía intravenosa en ratos.É de 0,5 ± 0,12 mg/kg.Este encima ten efectos anticoagulantes e hemolíticos evidentes.A molécula tóxica de PLA2 consta de 123 residuos de 18 tipos de aminoácidos.A molécula é rica en cisteína (14), ácido aspártico (14) e glicina (12), pero só contén unha metionina e o seu N-terminal é residuo de serina.En comparación co PLA2 illado por Tuguang, o peso molecular e o número de residuos de aminoácidos das dúas isoenzimas son moi similares e a composición de aminoácidos tamén é moi similar, pero o número de residuos de ácido aspártico e prolina é algo diferente.O veleno de cobra real de Guangxi contén PLA2 rico.Shu Yuyan et al.(1989) illaron un PLA2 do veleno, que ten unha actividade específica 3,6 veces maior que o veleno orixinal, un peso molecular de 13000, unha composición de 122 residuos de aminoácidos, un punto isoeléctrico de 8,9 e unha boa estabilidade térmica.A partir da observación do microscopio electrónico do efecto do PLA2 básico sobre os glóbulos vermellos, pódese ver que ten un efecto evidente na membrana dos glóbulos vermellos humanos, pero non ten un efecto evidente nos glóbulos vermellos de cabra.Este PLA2 ten un evidente efecto de retardo na velocidade electroforética dos glóbulos vermellos en humanos, cabras, coellos e cobayas.Chen et al.Este encima pode inhibir a agregación plaquetaria inducida polo ADP, coláxeno e ácido araquidónico sódico.Cando a concentración de PLA2 é de 10/xg/ml~lOOjug/ml, a agregación plaquetaria está completamente inhibida.Se se usasen plaquetas lavadas como materiais, o PLA2 non podería inhibir a agregación a unha concentración de 20 Mg/ml.A aspirina é un inhibidor da ciclooxixenase, que pode inhibir o efecto da PLA2 sobre as plaquetas.A PLA2 pode inhibir a agregación plaquetaria hidrolizando o ácido araquidónico para sintetizar tromboxano A2.A conformación da solución de PLA2 producida polo veleno Agkistrodon halys Pallas na provincia de Zhejiang estudouse mediante dicroísmo circular, fluorescencia e absorción UV.Os resultados experimentais mostraron que a conformación da cadea principal deste encima era similar á do mesmo tipo de encima doutras especies e xéneros, a conformación do esqueleto tiña unha boa resistencia á calor e o cambio estrutural no ambiente ácido era reversible.A combinación do activador Ca2+ e encima non afecta o ambiente dos residuos de triptófano, mentres que o inhibidor Zn2+ fai o contrario.A forma en que o valor do pH da solución afecta a actividade enzimática é diferente dos reactivos anteriores.
No proceso de purificación do veleno de serpe PLA2, un fenómeno obvio é que un veleno de serpe contén dous ou máis picos de elución de PLA2.Este fenómeno pódese explicar do seguinte xeito: ① debido á existencia de isozimas;② Un tipo de PLA2 polimerízase nunha variedade de mesturas de PLA2 con varios pesos moleculares, a maioría dos cales están no intervalo de 9 000 ~ 40 000;③ A combinación de PLA2 e outros compoñentes de veleno de serpe complica o PLA2;④ Como o enlace amida do PLA2 está hidrolizado, a carga cambia.① E ② son comúns, con só algunhas excepcións, como PLA2 no veleno de serpe CrWa/w
Hai dúas situacións: ① e ②.A terceira condición atopouse no PLA2 no veleno das seguintes serpes: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, víbora palestina, víbora de area e terrible serpe de cascabel km.
O resultado do caso ④ fai que a velocidade de migración do PLA2 cambie durante a electroforese, pero a composición de aminoácidos non cambia.Os péptidos pódense romper por hidrólise, pero xeralmente aínda están unidos por enlaces disulfuro.O veleno da serpe de cascabel oriental contén dúas formas de PLA2, chamadas PLA2 tipo a e tipo p respectivamente.A diferenza entre estes dous tipos de PLA2 é só un aminoácido, é dicir, a glutamina nunha molécula de PLA2 é substituída por ácido glutámico na outra molécula de PLA2.Aínda que a razón exacta desta diferenza non está clara, en xeral crese que está relacionada coa desaminación de PLA2.Se o PLA2 no veleno da víbora palestina se mantén quente co veleno bruto, os grupos finais das súas moléculas enzimáticas converteranse en máis que antes.De C PLA2 illado do veleno de serpe ten dous N-terminais diferentes, e o seu peso molecular é de 30.000. Este fenómeno pode ser causado polo dímero asimétrico de PLA2, que é semellante ao dímero simétrico formado por PLA2 no veleno da serpe de cascabel diamondback oriental. e a serpe de cascabel western diamondback.A cobra asiática está composta por moitas subespecies, algunhas das cales non están moi definidas na súa clasificación.Por exemplo, agora recoñécese o que antes se chamaba subespecie Cobra do Caspio Exterior
Debería atribuírse á cobra do mar Caspio exterior.Como hai moitas subespecies e están mesturadas entre si, a composición do veleno de serpe varía moito debido ás diferentes fontes e o contido das isozimas PLA2 tamén é alto.Por exemplo, veleno de cobra
Atopáronse polo menos 9 tipos de isozimas PLA2 de especies r ^ ll e atopáronse 7 tipos de isozimas PLA2 no veleno da subespecie de cobra do Caspio.Durkin et al.(1981) estudaron o contido de PLA2 e o número de isozimas en diferentes velenos de serpes, incluíndo 18 velenos de cobra, 3 de mamba, 5 de víbora, 16 de cascabel e 3 de serpes mariñas.En xeral, a actividade PLA2 do veleno de cobra é alta, con moitas isozimas.A actividade PLA2 e as isozimas do veleno de víbora son medias.A actividade PLA2 do veleno de mamba e do veleno de cascabel é moi baixa ou ningunha actividade de PLA2.A actividade PLA2 do veleno das serpes mariñas tamén é baixa.
Nos últimos anos, non se informou de que o PLA2 no veleno de serpe exista en forma de dímero activo, como a serpe de cascabel rombophora oriental (o veleno de serpe C. contén PLA2 tipo a e tipo P, ambos compostos por dúas subunidades idénticas). , e só ten a dimerase
Actividade.Shen et al.tamén propuxo que só o dímero de PLA2 do veleno de serpe é a forma activa do encima.O estudo da estrutura espacial tamén proba que o PLA2 da serpe de cascabel occidental de diamante existe en forma de dímero.Composto piscívoro
Hai dous PLA ^ Ei e E2 diferentes de veleno de serpe, nos que 仏 existe en forma de dímero, o dímero está activo e o seu monómero disociado é inactivo.Lu Yinghua et al.(1980) estudaron aínda máis as propiedades físicas e químicas e a cinética de reacción de E. Jayanthi et al.(1989) illaron un PLA2 básico (VRVPL-V) do veleno da víbora.O peso molecular do monómero PLA2 é de 10000, que ten efectos letais, anticoagulantes e edema.O encima pode polimerizar polímeros con diferentes pesos moleculares baixo a condición de PH 4,8, e o grao de polimerización e o peso molecular dos polímeros aumentan co aumento da temperatura.O peso molecular do polímero xerado a 96 °C é de 53 100, e a actividade PLA2 deste polímero aumenta en dous
Hora de publicación: 18-novembro-2022